Статьи

Введение. Производство Fc-слитых белков в прокариотических системах приводит к образованию нерастворимых агрегатов из-за неправильного сворачивания полипептидных цепей. Для получения функциональных белков требуется стадия рефолдинга, процесс подбора условий которого может быть трудоемким. Оптимизация параметров ренатурации с помощью подхода дизайна эксперимента (Design of Experiments, DoE) позволяет рассчитать оптимальные параметры процесса и оценить влияние факторов и их взаимодействий.
Цель. Оценка влияния концентраций окислителя, восстановителя и pH буфера ренатурации на эффективность рефолдинга Fc-слитого белка in vitro и определение оптимальных условий. Материалы и методы. В работе использовали тельца включения Fc-слитого белка, полученные в бактериальной системе экспрессии Escherichia coli BL21. Планирование эксперимента осуществляли с помощью ортогонального композиционного дизайна (Orthogonal Central Composite design, CCO). Дизайн эксперимента, статистическую обработку данных и оптимизацию параметров производили в программе MODDE (v. 12.1, Sartorius Stedim Data Analytics AB, Германия). В качестве откликов использовали показатели хроматографической чистоты и выход целевого белка по данным высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии. Результаты и обсуждение. Проведена оптимизация условий ренатурации Fc-слитого белка с применением подхода DoE. На основании полученных данных были построены графики поверхности откликов и определены оптимальные значения параметров pH буферной среды, концентрации окислителя и восстановителя. Полученные статистические модели демонстрируют высокую прогностическую способность и воспроизводимость данных. Была проведена успешная валидация процесса рефолдинга в оптимизированных условиях. Наблюдали снижение количества высокомолекулярных примесей и неправильно свернутых форм белка в целевом продукте. Значение хроматографической чистоты целевого белка по данным высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии удалось повысить более чем на 10 %.
Заключение. Было установлено значительное влияние pH буферного раствора, соотношения концентраций окислительно-восстановительной пары и их взаимное влияние на выход и хроматографическую чистоту Fc-слитого белка. Показана тесная взаимосвязь эффектов окислительного и восстановительного компонентов с pH раствора. Повышенный pH буферной среды улучшает растворимость белка, что создает лучшие условия для правильного сворачивания полипептидной цепи.

Введение. В последнее десятилетие пептиды с молекулярной массой менее 5 кДа используется в медицине и биотехнологии для лечения различных заболеваний. Химический синтез пептидов имеет ограничения, такие как низкий выход и эффективность синтеза, сложность масштабирования. Альтернативой является использование Escherichia coli. Разработка эффективной технологии синтеза пептидов остается актуальной задачей в связи с низкой продуктивностью штаммов-продуцентов. Цель. Разработка высокоэффективных штаммов Escherichia coli BL21, экспрессирующих терапевтические пептиды молекулярной массой менее 5 кДа, и технологии их культивирования. Материалы и методы. Генетические конструкции получили с использованием рестриктазно-лигазного метода, подлинность подтвердили секвенированием по Сенгеру. Технологию культивирования разработали с использованием подхода Design of experiments. Валидацию условий культивирования проводили в биореакторе Biostat B. Гибридные белки очищали методом металл-хелатной хроматографии, целевые пептиды получали гидролизом с помощью ULP-протеазы. Количественное содержание целевого белка определяли капиллярным электрофорезом, подлинность белка – ВЭЖХ-МС и косвенным неконкурентным ИФА. Результаты и обсуждение. В ходе исследований разработаны высокоэффективные штаммы-продуценты пептидов и оптимальные условия культивирования: рН – 7,5 ± 0,5, температура культивирования – 37 °C, оптическая плотность индукции – 2,7 ± 0,3, концентрация ИПТГ – 0,05 мМ. Продуктивность штаммов-продуцентов достигла 4,82 ± 0,05 г/л. Получены образцы очищенных пептидов. Заключение. Разработанная технология позволяет получить пептиды с высоким выходом, не описанным ранее исследователями. Практическая значимость данной работы заключается в возможности применения данной технологии для получения пептидов с различными физико-химическими свойствами.